通用ELISA試劑盒開發(fā)技術(shù)
廣州健侖生物科技有限公司研究所.徐華
●用途原理
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）是一種常用的免疫檢測技術(shù)，具有敏感特異、簡便實用、標準穩(wěn)定等特點，已經(jīng)成為被廣泛采用的檢測手段。然而，ELISA的工作準備煩瑣而復(fù)雜，許多試劑需要臨時配置，不僅費時費力，而且影響結(jié)果的重復(fù)性。
為此，我公司吸收國內(nèi)外先進技術(shù)，結(jié)合自身成熟工藝，開發(fā)出通用的即開即用ELISA試劑盒，適應(yīng)于各種抗原抗體ELISA的建立。該盒幾乎囊括了ELISA自包被到結(jié)果判斷過程中所需的各種關(guān)鍵性試劑，并已加工成工作狀態(tài)，達到開盒即用的效果；同時還提供了具體詳細的操作流程和注意事項，可以協(xié)助操作者順利完成ELISA試驗。
試劑盒讓ELISA操作變得簡單、方便！
●試劑組成
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1.空白微孔板(48/96T) 1套; |
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5.顯色劑TMB (4號液) 1瓶; |
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2.酶結(jié)合物稀釋液(1號液) 1瓶; |
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6.樣本稀釋液 (5號液) 1瓶; |
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3.洗滌劑 (2號液) 1瓶;
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7.終止液 (6號液) 1支; |
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4.底物（3號液） 1瓶 |
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8.使用說明書 1份; |
●操作程序
包被流程
1.將包被蛋白用包被液按比例稀釋，參考濃度5ug—50ug/ml不等，純度高的蛋白濃度可以低一些，反之亦然；充分稀釋后，按100ul/孔準確加樣。2-8℃18小時。
2.甩去孔中液體，用0.05M氯化鈉溶液注滿各孔，再甩去。
3.加入封閉液，充分溶解混勻。按120ul/孔加入各孔。37℃2小時，甩去后拍干即可使用。臨時保存可以放入自封袋內(nèi)，密封后置于2-8℃保存。
檢測流程
1. 樣本稀釋:用樣本稀釋液(5號液)將待檢樣本按合適比例稀釋(一般間接法ELISA為1：100)。
2. 加樣反應(yīng):每孔加已稀釋樣本100ul。同時設(shè)陰性、陽性及空白對照各一孔?？瞻讓φ湛? 加入100ul樣本稀釋液(5號液)。37℃溫育,時間一般為30-60分鐘，甩去，每孔加洗滌液(2號液)一滴,立即用蒸餾水加滿，靜止30秒，甩去；如此洗滌五次,甩去,拍干。
3. 加酶反應(yīng):將酶結(jié)合物用酶結(jié)合物稀釋液(1號液)按參考比例稀釋，而后按100ul/孔加入, 37℃反應(yīng)30-60分鐘。甩去,加洗滌液(2號液)一滴,立即用蒸餾水同上洗滌五次,甩去,拍干。
4. 顯色反應(yīng):加底物(3號液)和顯色劑(4號液)各一滴，混勻, 37℃下放置3-10分鐘,加終止液(6號液)一滴混勻,終止反應(yīng)。
●結(jié)果判斷
1．肉眼觀察:淺于近于陰性對照為陰性; 呈明顯深于陰性對照的藍色為陽性。
2．儀器判斷:450nm讀取O.D值,待檢孔O.D值大于陰性對照2.1倍者為陽性.空白對照調(diào)零。當陰 性對照O.D值低于0.07時,按0.07計算。
● 問題與技巧
ELISA是一種敏感的免疫學檢測方法，容易受到各種因素的干擾。要保證實驗的可靠性，必須注意每個環(huán)節(jié)。以下是常見的問題以及相關(guān)的解決方法：
1 包被不上抗原（抗體）：
* 包被抗原應(yīng)是可溶性的，不溶性蛋白結(jié)合性能很差，比如一些重組蛋白包涵體、組蛋白、膠元旦白或脂類抗原。
解決：可以采用改變包被液PH，采用尿素溶解，改變?nèi)軇┑确椒▽⒖乖優(yōu)榭扇苄浴?/span>
* 包被抗原分子量太小，如合成多肽類。
解決：可以采用共價鍵結(jié)合模式，包被抗原。
* 包被抗原的濃度不夠。
解決：可以適當提高包被抗原量或選取高吸附包被板，但過度包被會形成疊層，反而影響實際
結(jié)合量，甚至造成本底升高。
* 包被液PH不當會改變蛋白質(zhì)的電荷狀況，直接影響空間結(jié)構(gòu)及抗原表位。
解決：可以測定等電點（PI），并系列改變PH，以尋求最適的PH值。
此外，在包被抗體時，適當預(yù)先低度變性，可以增加包被量。
2 本底很高
* 抗原本身不純，如有交叉表位，或有雜蛋白成分等。
解決：雜蛋白可以通過鹽析、層析純化去除；而交叉表位處理較為復(fù)雜，需要在表位選擇時認真考慮。
* 包被板封閉不佳，在包被板上留有較多的空白。
解決：提高封閉劑濃度，選擇更有效的封閉蛋白。
* 樣本問題，首先是稀釋不夠：間接法ELISA一般要求血清稀釋在1：50以上，其它體液可以濃度大一些；
解決：系列稀釋樣本，以選擇最佳比例。
* 其次，樣本高脂、高色素、溶血以及污染長菌，都有可能造成本底上升；
解決：要采用新鮮無溶血標本，低溫凍存。
* 最后可能與樣本稀釋液有關(guān)，樣本稀釋液的PH、離子強度等都會影響非特異性結(jié)合；
解決：可以采用可靠的樣本稀釋液或自行調(diào)整PH、緩沖系等條件。
* 酶濃度過高，造成非特異性上升；
解決：應(yīng)當選擇恰當酶濃度。
3 反應(yīng)強度不夠
* 除與抗原活性、包被效果相關(guān)外，主要受酶結(jié)合物性質(zhì)和濃度的影響。一般，稀釋后的酶結(jié)合物失活很快，半衰期僅3天。
解決：采用本試劑盒的酶稀釋液可以有效保護酶活性，大大延長酶反應(yīng)能力。此外，采用高純度的二抗（有親和層析的單克隆抗體酶最佳）。
延長反應(yīng)時間也可以一定程度提高反應(yīng)強度。
4 顯色問題
* 全部白板。原因與漏加酶液，酶液失活，顯色體系失效等。
解決：可以取確認正常的酶液20ul，直接滴加底物和顯色劑各一滴，觀察顯色情況。正常應(yīng)在60秒鐘出現(xiàn)明顯蘭色，否則，應(yīng)認為顯色體系有問題，需要更換。
* 肉眼觀察顏色很深，酶標儀讀數(shù)卻很低。如儀器工作正常，往往是選擇的波長不匹配。
解決：TMB顯色劑被硫酸終止后，呈黃色，應(yīng)在450NM處測定（注意：另外一種顯色劑OPD則在492NM測定）。
* 定量測定抗原或抗體時，線性范圍窄。
解決：ELISA的反應(yīng)在O.D值0.2-1.0區(qū)間較為穩(wěn)定，超出以后，系統(tǒng)誤差加大，變得不太穩(wěn)定?？梢栽谡{(diào)整反應(yīng)到此區(qū)間。
5 操作過程中的其它問題與解決，見附表：
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