漢坦病毒檢測難題終攻克
寧波大榭檢驗檢疫局公共衛(wèi)生實驗室從樣本制備到得出檢測結(jié)果，與原來使用特異性套式分型引物鑒定方法相比，CODEHOP RT-PCR檢測技術(shù)大幅度縮短了檢測時間，總耗時不到4小時，并且具有操作簡便、特異性強，靈敏度高的特點，填補了國內(nèi)外空白，達到了國際領(lǐng)先水平。
對鼠類樣本進行檢測
病毒流行 急需技術(shù)防控
據(jù)了解，漢坦病毒可引起腎綜合征出血熱和漢坦病毒性肺綜合征，前者臨床上以發(fā)熱、出血、腎臟損害為主，國內(nèi)較常見；而后者主要臨床表現(xiàn)為，在4日左右的發(fā)熱、頭痛等前驅(qū)期癥狀后，出現(xiàn)以非心源性肺水腫和高病死率（52.4%~78.0%）為特征的急性呼吸衰竭，重癥3日～7日死亡，主要流行于美國，在阿根廷、巴西等國也發(fā)現(xiàn)過病例，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)，但有發(fā)生的可能。
研究表明，在自然界中存在較多型別的漢坦病毒，且不同型的致病性也不一樣。目前，漢坦病毒遍及亞洲、歐洲、非洲、美洲、大洋洲等70多個國家，其流行之廣，危害之重，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
在國內(nèi)，漢坦病毒的感染情況尤為嚴重，每年感染漢坦病毒導(dǎo)致發(fā)病的人數(shù)占世界報道病例數(shù)的90％以上，近10年來我國年報告發(fā)病人數(shù)一直高達4萬～6萬人，而且新疫區(qū)不斷出現(xiàn)。同時，還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了新型別的漢坦病毒，如哈巴羅夫斯克病毒、阿穆爾病毒、索托帕拉雅病毒等。
漢坦病毒不僅感染人，而且被許多嚙齒類動物特別是食蟲目動物長期攜帶，更嚴峻的是，這些作為傳染源的宿主動物范圍仍在持續(xù)擴大，而且一種宿主動物還可能同時攜帶不同型別的漢坦病毒，這對該病毒的檢測防控提出了更大的挑戰(zhàn)。
因此，不斷拓展對該病毒的研究、完善技術(shù)防控體系成為了一項重大課題。大榭局公共衛(wèi)生實驗室圍繞關(guān)鍵技術(shù)、疑難問題，經(jīng)過1年多的科研攻關(guān)，研制出了“漢坦病毒群的簡并RT-PCR”檢測技術(shù)。2012年5月，該技術(shù)的相關(guān)科研課題《鼠類攜帶未知病毒簡并PCR檢測方法建立與應(yīng)用》順利獲得國家質(zhì)檢總局立項，大大提升了大榭局的技術(shù)支撐力量。
眼光獨到 創(chuàng)新檢測方法
創(chuàng)新是科學的生命力?？蒲泄リP(guān)前期，經(jīng)過深入研究分析，大榭局研究團隊清楚地認識到，現(xiàn)有漢坦病毒的基因?qū)W檢測方法主要針對特定型別的漢坦病毒進行檢測，但是由于漢坦病毒群型別眾多，同時具有快速進化變異的特點，一些新型的漢坦病毒不斷出現(xiàn)，迫切需要建立能夠?qū)ξ粗蜐h坦病毒的檢測方法。
此外，該團隊還考慮到，針對這些病原體，分離培養(yǎng)、直接或間接熒光抗體檢測、免疫組化染色、酶聯(lián)免疫反應(yīng)等傳統(tǒng)檢測方式，都需要較高的實驗室設(shè)備和條件，相對而言核酸檢測技術(shù)的設(shè)備條件要求較低，并且具有特異性強、靈敏度高、快速便捷等特點。
因此，研究團隊以獨到的眼光，首創(chuàng)應(yīng)用CODEHOP-PCR方法檢測漢坦病毒屬內(nèi)各類病毒。CODEHOP技術(shù)，是一種新型的簡并引物的設(shè)計方法，兼有簡并性和特異性的特點，能夠在保證PCR擴增特異性的同時，可以擴增編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。而PCR是上世紀80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)，可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。CODEHOP-PCR方法檢測取兩者之長，能夠方便、快速地擴增鑒別新的物種和親緣性較遠的序列，當懷疑一種未知病原體為某病毒或細菌家族的成員，或一個未知基因是某基因家族成員時，可以進行有效驗證，也可以用于某病毒家族成員內(nèi)新病毒的檢測和發(fā)現(xiàn)，很好地解決了常規(guī)PCR引物只能擴增特定某種病原體或親緣關(guān)系較近病原體的問題。
以能夠檢測漢坦病毒屬內(nèi)已知和未知的病毒為目標，大榭局研究團隊充分發(fā)揮CODEHOP-PCR方法檢測的優(yōu)勢，設(shè)計篩選了一對簡并引物，對RT-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，提高了檢測的靈敏度、特異性，可以檢測國內(nèi)流行的流行性出血熱病毒中的漢城型病毒、漢坦型病毒，同時也可以檢測市面上試劑盒所不能檢測的其他型漢坦病毒，為該病毒的防控提供了一道堅實的技術(shù)屏障。
開展轄區(qū)鼠類監(jiān)測
應(yīng)用廣泛 立足工作實際
“我們開展的課題就是要從日常的口岸媒介攜帶病原體檢測工作實際出發(fā)，將檢測變得更快、更準確，同時又能檢測更多的病原體?！痹搱F隊負責人、高級工程師胡群如是說。
自建立CODEHOP RT-PCR檢測技術(shù)以后，就被應(yīng)用于大榭口岸日常檢獲的鼠類樣品攜帶漢坦病毒的檢測。2012年，大榭局研究團隊利用該方法，在輸入性鼠類樣品中檢測出漢坦病毒陽性，屬于浙江省首例，此外，在口岸日常監(jiān)測的鼠類樣品中還檢測到了2例漢坦病毒陽性。
此外，在該項技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究團隊還研制出了檢測試劑盒。今年7月31日，該試劑盒順利通過了國家技術(shù)發(fā)明專利授權(quán)。通過該試劑盒，研究團隊對實驗室分離保存的漢坦型、漢城型兩個漢坦病毒樣本以及其他型別的病毒基因進行了測試，均能得到預(yù)期效果。
這些應(yīng)用結(jié)果充分表明，大榭局公共衛(wèi)生實驗室創(chuàng)建的CODEHOP RT-PCR方法非常適用于口岸鼠類攜帶漢坦病毒的快速檢測，具有廣泛的推廣前景。
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聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是上世紀80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。
CODEHOP PCR（一致-簡并雜合寡核苷酸引物擴增）方法是Rose等人發(fā)明用于擴增某種病原體或親緣關(guān)系較近的病原體的核酸檢測方法，已經(jīng)有許多研究未知病毒、細菌以及基因家族成員功能的工作因此得以開展并取得成功。
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