質(zhì)粒的鑒定、提取與純化
一、菌落PCR法快速鑒定陽性克隆
1、菌落PCR引物的設(shè)計(jì)
①、為了最大程度避免菌落PCR出現(xiàn)假陽性結(jié)果，原則上應(yīng)將引物的一端設(shè)計(jì)在載體上，另一端設(shè)計(jì)在插入片段上，長度25堿基足矣；
②、為減少非特異性片段的產(chǎn)生，同時(shí)保證兩步法能夠有效擴(kuò)增出目的片段，建議將引物的Tm值設(shè)計(jì)在62-68℃之間；
注：Tm值的計(jì)算請采用“最鄰近法”（the nearest neighbor method），該法計(jì)算準(zhǔn)確度較高，為多種計(jì)算機(jī)軟件所采用（需要相關(guān)軟件的同學(xué)請到FTP上下載“Molecular.Biology.Insights.Oligo.v7.37.zip”）。金斯瑞引物合成單上的Tm值經(jīng)驗(yàn)證完全不準(zhǔn)，請無視之！
③、引物設(shè)計(jì)時(shí)請適當(dāng)考慮通用性，如插入片段為RxR，則可將引物設(shè)計(jì)在DBD區(qū)，相比之下，對這一區(qū)域做缺失研究的人較少，載體以PGL3系列載體為例，可將引物設(shè)計(jì)在熒光素酶的基因序列上，保證對PGL3-Basic、Promoter和Enhancer均有效；
④、目的片段長度在500 bp以上較為合適，一方面可以檢測兩段引物之間的序列是否出現(xiàn)缺失或插入，另一方面跑膠時(shí)條帶也比較明顯（堿基數(shù)越多則結(jié)合的染料越多）。
2、菌落PCR步驟
①、牙簽挑取單菌落后，浸泡于200 μL無抗LB培養(yǎng)基中，旋渦混勻5-10 s，使菌體在培養(yǎng)基中均勻分布；
注：挑選單菌落時(shí)請?zhí)魝€(gè)頭中等，不大不小的菌落，這樣的菌落呈陽性的概率較高。一般情況下，含有空載體的菌生長較快，故菌落大，不宜挑取，菌落太小則無法區(qū)分是空載體菌落還是還有目的片段的菌落，亦不可取。此為經(jīng)驗(yàn)之談，具體原因不明。
②、吸取1 μL菌液作為模板，進(jìn)行15 μL體系的兩步法PCR（68℃延伸，98℃解鏈），剩余菌液4℃存放備用；
注：預(yù)變性（94℃）時(shí)間應(yīng)延長至10 min，使菌體破裂。目標(biāo)片段為1000 bp左右時(shí)，20循環(huán)已足夠，若目標(biāo)片段為500 bp左右，則建議進(jìn)行25循環(huán)。菌液（尤其是DH5α）在接種前不可進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，否則容易導(dǎo)致小搖失?。ú婚L菌），經(jīng)驗(yàn)之談，原因不明。
③、PCR產(chǎn)物鑒定：方法一（推薦）：取PCR產(chǎn)物（10 μL左右），加Loading Buffer后跑膠鑒定，凡沒有特異性條帶或泳道中明顯的條帶不止1條的，均可判定為陰性菌落，棄之。方法二（不太推薦，趕時(shí)間的話可以試試）：在PCR產(chǎn)物（10 μL左右）中直接加入用TAE按1/10稀釋后的“UltraPower”熒光染料1 μL，混勻后等待30 s，之后于365 nm紫外燈下觀察顏色變化，溶液呈濃綠色的可認(rèn)定為陽性菌落（即PCR能夠擴(kuò)增出產(chǎn)物，但是不是特異不好說，根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，該法產(chǎn)生假陽性的概率<10%）；
④、將陽性菌落所對應(yīng)的菌液轉(zhuǎn)接于20 mL含抗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15-16小時(shí)，保種后提取質(zhì)粒（如有必要，可送測序）。
二、質(zhì)粒的提取與內(nèi)毒素的去除
1、小提試劑盒提取質(zhì)粒
①、取菌液16 mL，平均分到4個(gè)離心管，離心后收集菌體，按小提試劑盒的說明書操作，提取質(zhì)粒；
注：16 mL菌液裂解后，以兩個(gè)吸附柱吸附即可（理論上可吸附80 μg質(zhì)粒），使用更多的吸附柱不會提高回收率（經(jīng)驗(yàn)）。另外，菌液多不代表質(zhì)粒就提得多，16 mL與20 mL，在相同的裂解體系下，其質(zhì)粒提取總量相差不會超過10%（經(jīng)驗(yàn)）。因此，使用過多的菌液除了增加產(chǎn)物中內(nèi)毒素的含量外，無實(shí)際意義。
②、最后一步洗脫時(shí)，建議每個(gè)吸附柱加洗脫液（水或TE）100 μL，洗脫一次后，再將洗脫液吸回吸附柱中，重復(fù)洗脫一次，一般情況下可提高洗脫率20%左右，同時(shí)建議暫時(shí)保留吸附柱，待檢測質(zhì)粒含量后再決定是否進(jìn)行第三次重復(fù)洗脫。若菌體長勢良好，該步驟可獲得質(zhì)粒約60-75 μg。
注：采用更多地洗脫液有助于提高回收率，但過大的溶液體積將導(dǎo)致后續(xù)步驟（異丙醇沉淀DNA）中質(zhì)粒的損失，故建議洗脫液用量為每柱100-125 μL。
2、內(nèi)毒素去除
①、取質(zhì)粒溶液，加入0.125倍體積的3 mol/L乙酸鈉溶液（pH5.0），置于冰上預(yù)冷5 min；
②、向預(yù)冷的溶液中添加0.125倍體積的去內(nèi)毒素試劑（Endotoxin-Be-Gone），混勻后在冰上靜置10 min；
③、將溶液轉(zhuǎn)移到65℃水浴鍋中，放置0.5-1 min，此時(shí)可見溶液變渾濁；
④、取出渾濁液于12000 rpm下離心2 min，轉(zhuǎn)移上清液；
注：天冷時(shí)，③、④兩步的間隔時(shí)間要短，動作要快，否則內(nèi)毒素去除試劑將無法通過離心去除。此外，室溫在25℃以上時(shí)，內(nèi)毒素去除效果較好，步驟②-④做兩次即可，室溫較低時(shí)，應(yīng)做三次，以保證內(nèi)毒素去除率。
3、質(zhì)?；厥?/span>
方法一（沉淀法）：
①、內(nèi)毒素去除后，加入1倍體積的異丙醇，于12000 rpm離心20 min左右（可在室溫下進(jìn)行）或加入2倍體積的無水乙醇，于12000 rpm冷凍離心20 min左右，即可在離心管底部看見DNA沉淀；
②、若采用異丙醇沉淀，則用75%乙醇清洗沉淀2次（12000 rpm，離心5 min）除鹽；若采用乙醇沉淀，則清洗1次足夠；
③、棄去上清液，空干乙醇，溶解質(zhì)粒。
方法二（吸附法）：
內(nèi)毒素去除后，加入0.4倍體積的3 mol/L乙酸鈉，取小提柱2根，將溶液均勻添加在吸附柱中，按試劑盒說明書回收質(zhì)粒。
注：兩種方法對質(zhì)粒的回收效果沒有顯著區(qū)別（回收率為70%-85%），但相對來說異丙醇沉淀法對操作要求較高，且耗時(shí)較長，故建議使用吸附法。
廣州健侖生物科技有限公司
徐華
2005/03/28
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