單核細(xì)胞增生性李斯特菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
1. 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)及鑒定方法
食品中單增李斯特菌的傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法是將分離培養(yǎng)后的可疑菌落做生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、協(xié)同溶血實(shí)驗(yàn)(CAMP)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及典型運(yùn)動(dòng)等鑒定,被確定為李斯特菌后進(jìn)一步進(jìn)行血清分型; 增菌和選擇性增菌是不可缺少的步驟,而增菌主要包括兩種:冷增菌和快速增菌。前者是將樣品置于胰蛋白胨水中4℃～5℃增菌1個(gè)月,再劃線分離;由于冷增菌時(shí)間長(zhǎng)(4℃, 30 d甚至1年),已被快速增菌法取代。國(guó)際常用的增菌法主要有國(guó)際乳業(yè)聯(lián)盟(IDF)、美國(guó)食品藥品管理局(FDA)及美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)的增菌法。IDF法是將待檢樣品接IDF法是將待檢樣品接種于EB培養(yǎng)基,經(jīng)30℃, 48h培養(yǎng)后,于OXFORD平板劃線分離,選擇培養(yǎng),然后用斜光法觀察菌落, CAMP檢驗(yàn),最后鑒定分型。 FDA為美國(guó)官方負(fù)責(zé)食品衛(wèi)生監(jiān)督的機(jī)構(gòu),其所制定的方法為國(guó)際上公認(rèn)的權(quán)威方法之一,因此許多檢測(cè)方法都以FDA法作為對(duì)比參照。其主要步驟是將樣品接種在含放線菌酮的LEB肉湯中培養(yǎng),分別在第1天和第7天轉(zhuǎn)接在MMLA平板上分離。USDA法是將樣品接種在UVM-LEB(university of
Vermont modified Lisiteria enrichment broth)肉湯中,再轉(zhuǎn)到FB(Fraser
broth)培養(yǎng)基中,分別在30℃和35℃兩次增菌,于MMLA或MOX平板上劃線分離。
除上述3種方法外,國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)在ISO11290-1中采用增菌液為DFB(demi-fraser broth)和FB的兩級(jí)增菌法。另外還有一種RSK法,也是采用兩次增菌, 20h可使單增李斯特菌達(dá)到107個(gè)/ml。我國(guó)使用的檢測(cè)單增李斯特菌方法主要有國(guó)標(biāo)法(GB 4789.30-1994)和SN法(SN0 184-1993)。
國(guó)標(biāo)法在LEB中前增菌后,劃線于選擇性培養(yǎng)基MMA,再分別于SIM和TSI上分離培養(yǎng),其后于TSA-YE培養(yǎng)基上純化菌落,進(jìn)一步做生化鑒定,報(bào)告結(jié)果。SN法一般將樣品置于MBP中前增菌,然后在EB中增菌,分別劃MMA和OXA平板,于TSA-YE平板上純化菌落,純化的菌落接種于TSB-YE中培養(yǎng)過(guò)夜進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn),報(bào)告結(jié)果。
2. 顯色培養(yǎng)基快速鑒定技術(shù)
基本原理：針對(duì)單增李斯特菌的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶,設(shè)計(jì)相應(yīng)的底物,加入到常規(guī)選擇性培養(yǎng)基中,利用酶對(duì)底物的分解,產(chǎn)生熒光物質(zhì)或顯色物質(zhì),使其菌落形態(tài)或顏色不同于其他李斯特菌和非李斯特菌,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌快速定性鑒定和菌落數(shù)目的快速定量。Notermans等1991年首次用plcA基因產(chǎn)物磷脂酰肌醇(PI)特異性的磷脂酶C(PI-PLC)來(lái)檢測(cè)單增李斯特菌,通過(guò)與L-α-磷脂酰肌醇顯色底物進(jìn)行特異性生化反應(yīng),在菌落周?chē)a(chǎn)生不溶于水的脂肪酸,形成明顯的沉淀環(huán),實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌的一步鑒定。另一種PI-PLC的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-肌醇-1-磷酸鹽,致病性的單增李斯特菌在以該底物設(shè)計(jì)的顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出綠色的菌落,無(wú)致病性李斯特菌為白色菌落。Facon和Simon于1998年利用該物質(zhì)作底物開(kāi)發(fā)成功顯色培養(yǎng)基并申請(qǐng)了專(zhuān)利。在同一年, Schabert和Restaino利用4-甲基傘形酮-肌醇-1-磷酸鹽作為PI-PLC酶的底物,開(kāi)發(fā)出熒光顯色培養(yǎng)基,也申請(qǐng)了專(zhuān)利。
3. 數(shù)值分類(lèi)鑒定和新型計(jì)數(shù)技術(shù)
對(duì)傳統(tǒng)的生化反應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,找出代表李斯特菌的特征性生化反應(yīng),利用數(shù)值分類(lèi)技術(shù),編出相應(yīng)的代碼表,簡(jiǎn)化傳統(tǒng)的生化鑒定步驟,達(dá)到快速鑒定。最有代表性的就是現(xiàn)在商業(yè)化的微量生化鑒定管,其中最常用且普遍被認(rèn)可的是TheAPI-Listeria test。它共包括10個(gè)生化反應(yīng),通過(guò)查詢(xún)代碼表可以對(duì)單增李斯特菌和李斯特屬內(nèi)的菌種快速鑒定。傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)以平板計(jì)數(shù)和MPN兩種方法為主。傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)以平板計(jì)數(shù)和MPN兩種方法為主。目前有多種技術(shù)將常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)或替代,主要體現(xiàn)在勿需瓊脂平板或簡(jiǎn)化瓊脂傾注平板。其中的疏水網(wǎng)膜(HGMF)技術(shù)適用于好氧菌計(jì)數(shù),它采用的ISO-GRIO系統(tǒng),具有1600個(gè)小方格的網(wǎng)膜,能濃縮樣品細(xì)菌,除去抑制物,同時(shí)利于細(xì)菌在培養(yǎng)基間轉(zhuǎn)移時(shí)活力的恢復(fù)。
4. 免疫檢測(cè)技術(shù)
Farber等首先于1987年報(bào)道了針對(duì)單增李斯特菌鞭毛抗原的單克隆抗體ELISA檢驗(yàn)程序。首先用硝酸纖維素膜過(guò)濾污染樣品,然后將濾膜置于改良的McBride李斯特菌分離培養(yǎng)基上,在30℃下培養(yǎng)48 h后移去膜,用對(duì)單增李斯特菌特異的單抗酶免疫法檢驗(yàn),該法可在2～3 d內(nèi)從自然污染樣品中檢出單增李斯特菌。1992年,Bessesen等利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),首次制備一株能穩(wěn)定分泌抗單核增生李斯特菌特異性克隆抗體的細(xì)胞株em-7g1,所針對(duì)的蛋白質(zhì)分子量為60kd。以此特異的單克隆抗 體建立的夾心ELISA方法能于20～24 h內(nèi)檢測(cè)出8～10 cfu/g(ml),這在病原性李斯特菌的檢測(cè)方面實(shí)現(xiàn)了一次重大突破,第一次利用免疫學(xué)方法把單增李斯特菌與非病原性李斯特菌分開(kāi)。以抗原抗體免疫為基礎(chǔ), Tao Geng等(2004)研制的生物傳感器可在24h內(nèi)檢測(cè)出熱狗和香腸中污染的單增李斯特菌,增菌后可檢測(cè)10～100 cfu/g樣品。
5. 分子檢測(cè)技術(shù)
5.1 探針檢測(cè)技術(shù)
Data等1988年克隆出單增李斯特菌β溶血素基因的一個(gè)500bp DNA片斷并測(cè)序,以此序列合成4種寡核苷酸探針,以32P標(biāo)記該探針經(jīng)斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)證實(shí),該探針只與單增李斯特菌反應(yīng),與其他種的李斯特和屬外的細(xì)菌均呈陰性,表現(xiàn)出很好的特異性。Notermans S.等1989年克隆出編碼單增李斯特菌和英諾克李斯特菌的引起遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的基因(DTH-18)。該基因經(jīng)32P標(biāo)記制備成基因探針,通過(guò)斑點(diǎn)雜交能檢出絕大多數(shù)血清型的單增李斯特菌和英諾克李斯特菌。除了DNA分子可作為很好的靶序列外, RNA也是個(gè)很好的選擇,VITR Listeriakit就是針對(duì)RNA開(kāi)發(fā)的探針試劑盒。Roger Stephan等(2003)報(bào)告3h內(nèi)可得到結(jié)果,效果非常好。
5.2 PCR檢測(cè)技術(shù)
用于PCR檢測(cè)的特異引物,一種是依據(jù)單增李斯特菌的特異毒力基因序列設(shè)計(jì),常以hlyA、iap、inl、Dth-18作為靶序列。Xiaohui Zhou等2003年以actA作為靶序列,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物827bp,對(duì)單增李斯特菌有很高特異性,經(jīng)過(guò)在LEB中30℃16h增菌后,可達(dá)到在25g牛肉、25ml水或牛奶中檢出10cfu的水平。另一種是以單增李斯特菌的16S序列或16S/23S中間保守區(qū)域?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物,用PCR技術(shù)對(duì)單核增生李斯特菌的特異性進(jìn)行研究。 定量PCR技術(shù)的發(fā)展,科研人員開(kāi)始嘗試以分子手段對(duì)單增李斯特菌快速計(jì)數(shù)。Nogva et al運(yùn)用5′-核酸酶PCR對(duì)單增李斯特菌定量,Weon Sang Choi等運(yùn)用cPCR對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行定量。近年來(lái)采用PCR技術(shù)對(duì)單增李斯特菌檢測(cè),研究重點(diǎn)放在了樣品前處理方面。 G.Amagliania等利用順磁納米顆粒和傳統(tǒng)的苯酚、氯仿對(duì)樣品中DNA進(jìn)行更有效提取,以去除對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制因素,盡量避免培養(yǎng)增菌過(guò)程,從而大大提高特異性和減少檢測(cè)時(shí)間?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多基于PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)化試劑盒,其BAX_system已在2002年被英國(guó)農(nóng)業(yè)食品安全和監(jiān)測(cè)局(FSIS)采納用來(lái)檢測(cè)鮭魚(yú)中的單增李斯特菌。B.Becker等報(bào)告BAX系統(tǒng)檢測(cè)27個(gè)樣品,其中26個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)方法DIN11290-1和DIN 11290-2一致,只有一例假陽(yáng)性。在自然污染的樣品檢測(cè)中,培養(yǎng)24～48h后即得到較好的結(jié)果。
5.4 免疫-PCR檢測(cè)技術(shù)
Fluit等將免疫技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合,建立了新的檢測(cè)系統(tǒng)磁免疫PCR。它以單增李斯特菌單抗MAb55和MAbA包被磁珠,對(duì)樣品進(jìn)行前處理,將菌富集裂解,再以DTH基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,并以hlyA基因設(shè)計(jì)引物做進(jìn)一步驗(yàn)證,顯示單抗MAb55效果較好,可檢測(cè)出每g樣品一個(gè)細(xì)菌,十分靈敏。
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徐進(jìn)
2010/12/09
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