腸道病毒EV71核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
【名 稱】
中文名：腸道病毒71型(EV71)核酸擴增檢測試劑盒
英文名：human enterovirus type 71 (EV71) Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit
漢語拼音: chang dao bing du 71 xing he suan kuo zeng jian ce shi ji he
【目的】
本試劑盒適用于檢測疑似患者糞便、咽拭子標本、皰疹液或腦脊液等標本中腸道病毒71型(EV71)mRNA，適用于腸道病毒71型感染引起的手足口病的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。
【原理】
本試劑盒用Trizol提取腸道病毒71型(EV71)mRNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄作用生成cDNA，用一對腸道病毒71型(EV71)特異性引物結(jié)合一條特異性熒光探針，配以FQ-Buffer(內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等)、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過一步PCR-熒光探針體外擴增法對腸道病毒71型(EV71) RNA進行擴增，從而達到快速實時定量檢測之目的。
【組成】
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名 稱 |
數(shù) 量 |
規(guī) 格 |
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EV71 PCR MIX |
1 管 |
800μl/管 |
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酶反應系 |
1 管 |
80μl/管 |
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EV71陽性質(zhì)控品 |
1 管 |
100μl/管(1×107Copies/ml) |
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陰性質(zhì)控品 |
1 管 |
250μl/管 |
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DEPC水 |
1 管 |
2000μl/管 |
備注：Trizol等另行配備
【標本采集】
1. 適用標本類型：疑似病人糞便、咽拭子標本、皰疹液、腦脊液或病毒分離培養(yǎng)物標本等
2. 標本采集：
咽拭子標本：采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密閉送檢。
皰疹液：用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3~5ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。
腦脊液標本：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0~2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中。密閉送檢測。
糞便：用滅菌捻拭子拭取糞便或腹瀉物置入無菌玻璃管（含0.4ml 滅菌生理鹽水），用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。
【保存和運輸】上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺，采集標本應立即（12h內(nèi)）送達實驗室。
【適用儀器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500, ABI PRISM 7300, LightCycler等，LightCycler等毛細管的儀器，MJ Opticon系列或取得資格認證的定量PCR儀。
【使用方法】
1．RNA提取
1.1樣品處理
取50ul樣品(或陰性質(zhì)控品)加入150 ul Trizol reagents（RNA提取液）充分震蕩，室溫放置10min。
1.2.加入100ul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min， 4℃ 12,000rpm離心10min。
1.3.小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混勻，12,000rpm離心10min。
1.4.棄上清，加入500 ul 75%的DEPC乙醇，充分混勻，12,000rpm離心10min，小心吸去大部分乙醇。
1.5.將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20μl DEPC H2O溶解沉淀。
EV71陽性質(zhì)控品：直接取3μl進行PCR擴增。
2．PCR擴增
從試劑盒中取出EV71 -PCR MIX、酶反應系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：
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試劑 |
EV71 -PCR MIX |
酶反應系 |
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用量 |
20μl |
2μl |
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈0.2ml離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應管中分別加入22μl，向每管中加入處理后樣品(提取RNA)或EV71 -陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品3μl，10,000rpm瞬時離心10秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)，按對應順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品以及未知標本，并設(shè)置樣品名稱、標記熒光基團種類(報告基團FAM、猝滅基團TAMRA)和循環(huán)條件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700,ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器:循環(huán)條件: 30℃→5min，42℃→45分鐘，后93℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40個循環(huán)。
LightCycler等使用毛細管的儀器: 循環(huán)條件: 30℃→5min，42℃→45分鐘，93℃→2分鐘，后93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40個循環(huán)。
3. 結(jié)果分析判定
Ct 值小于37個循環(huán)的為陽性；Ct 值在37-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct 值仍然在37-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性(<5×102Copies)。
【質(zhì)控標準】
陰性質(zhì)控品：全部陰性
EV71 -陽性標準品：陽性對照的 Ct 值均應小于 30.0，且呈標準S型擴增曲線。
以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。
【注意事項】
初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書操作進行。
所有使用的離心管應高壓滅菌(推薦使用，而且必須不含RNA酶。
PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
試劑盒里不同組分不能混用。每盒試劑請于3 次內(nèi)使用完畢。
所有試劑及待檢標本應看作是傳染物質(zhì)。
【規(guī)格】40份/盒。
【貯藏及有效期】試劑盒應-20℃閉光保存，避免反復凍融。有效期10個月.
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