什么是RT-PCR
逆轉(zhuǎn)錄PCR
RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR。
RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補(bǔ)DNA。
RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。（檢測(cè)基因表達(dá)的方法，參見Northern Blot法。
RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。
RT-PCR有時(shí)候也會(huì)指代實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。
實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用熒光色素，目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素，例如SYBR Green熒光染料；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的一種熒光探針（probe），如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時(shí)不發(fā)光，當(dāng)反應(yīng)體系中存在雙鏈DNA時(shí)，SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合，此時(shí)才發(fā)光。Taqman探針帶有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，此時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)到。
real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結(jié)合，能用微量的RNA來找出特定時(shí)間、細(xì)胞、組織內(nèi)的特別表達(dá)的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”
3RT-PCR技術(shù)相關(guān)試劑
oligo: 多聚體，相當(dāng)于mRNA引物
AMV RT：禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶
MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶
dNTPs：脫氧核苷酸
RNase：RNA水解酶
PCR Buffer：RT-PCR緩沖液
MgCl2：2價(jià)鎂離子
PCR各步驟的目的
預(yù)變性
破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性，減少DNA 復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響，以利于引物更好的和模板結(jié)合，特別是對(duì)于基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個(gè)步驟。此外，在一些使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應(yīng)中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應(yīng)得以順利進(jìn)行。
三種循環(huán)
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
延伸時(shí)間原因
用PCR儀擴(kuò)增時(shí),(變性.退火,延伸)循環(huán)完成后,繼續(xù)72度延伸了10分鐘的原因：
1.延伸時(shí)間取決于待擴(kuò)增DNA片段的長(zhǎng)度。（當(dāng)然是在反應(yīng)體系一定的條件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度時(shí)的堿基摻入率為35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。
2.根據(jù)延伸速率推得，擴(kuò)增1kb以內(nèi)的DNA片段1min即可，而3-4kb則需要3-4min，依次照推。通常在最后一輪要適當(dāng)?shù)膶⒀由鞎r(shí)間延長(zhǎng)至4-10min，這樣做是使PCR反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量。
3.繼續(xù)72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量外，還有一個(gè)作用是：在用普通Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。
PCR引物的選擇
對(duì)靶序列中潛在的引物位點(diǎn)進(jìn)行分析， 這些位點(diǎn)應(yīng)該不會(huì)形成同源多聚體機(jī)構(gòu)，也沒有明顯的形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)，不會(huì)自身互補(bǔ)，與基因組中的其他序列無(wú)顯著的同源性。
（1）依據(jù)寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計(jì)算中提供的公式計(jì)算各引物的熔解溫度。
（2）選擇一對(duì)匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似，將產(chǎn)生一種大小和堿基組成合適的產(chǎn)物。兩條引物與所擴(kuò)增片段的GC含量都應(yīng)在40%-60%之間。
（3）對(duì)寡核苷酸的長(zhǎng)度和/或位置進(jìn)行細(xì)調(diào)。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無(wú)明顯的互補(bǔ)性。作為一條經(jīng)驗(yàn)性的規(guī)律，一條引物上不該含有三個(gè)連續(xù)的與另一條引物互補(bǔ)的核苷酸。
注意事項(xiàng)
(1)雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長(zhǎng)變性所需時(shí)間就越長(zhǎng)。如果變性溫度過低或變性時(shí)間過短，會(huì)使僅僅富含A+T區(qū)域變性。當(dāng)模板DNA的G+C含量超過55%的時(shí)需要更高的變性溫度。
(2) 復(fù)性過程采用的溫度至關(guān)重要如果復(fù)性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復(fù)性，擴(kuò)增效率將會(huì)降低。如果復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴(kuò)增。復(fù)性通常在比理論計(jì)算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進(jìn)行。
（3）PCR擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)目決定于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴(kuò)增的效率。一旦PCR反應(yīng)進(jìn)入幾何級(jí)數(shù)的增長(zhǎng)期，反應(yīng)會(huì)一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點(diǎn)上來說，擴(kuò)增產(chǎn)物中絕大多數(shù)應(yīng)該是特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，而非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該低到難以檢測(cè)到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個(gè)含有10的5次方個(gè)拷貝的靶序列的反應(yīng)體系中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后往往可以做到上述的理想情況。
- 上一篇：如何防治手足口??？ 2014/3/14
- 下一篇：禽流感檢測(cè)方法研究進(jìn)展 2014/3/14
